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如何检测饲料中的植物酶活性?以此来指导配方设计?_拜恩检测-专业第三方检测机构

发表时间:2022-04-13   来源:

 

植物酶属于饲料添加剂检测常见产品之一。植物酶可以提高动物的消化功能,催化机体内的生化反应,促进机体的新陈代谢,从而弥补因应激等原因消化酶分泌的减少。所以很多时候,类似植酸酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、果胶酶、淀粉酶等植物酶制剂会被作为很好的饲料添加剂,应用在饲料产品的生产加工里面。这时候,如果企业能够准确的把握酶活性、酶反应的相关数据就能够更好的设计一款符合市场需求的畜禽饲料。

植物酶

 

重庆某生物制品公司准备以植酸酶为研究对象,希望了解该植物酶活性来设计一款饲料产品。 植物酶活性的检测可以使用分光光度法进行测定,这一点,可以依据我国国家标准GB/T 18634-2009《饲用植酸酶活性的测定 分光光度法》来进行测定。通过实验室分析手段来进行评价, 我们可以用来筛选酶制剂的优劣,了解植物酶的最适反应温度、最适反应pH,pH的稳定性、底物的浓度对酶活性检测的影响等数据,从而完全反映添加植物酶后饲料的真实使用效果。所以,本次检测方案基本参考GB/T 18634-2009给出的方法。

 

一、方法原理分析

使用分光光度法检测植酸酶活性,原理主要是利用植酸酶在一定温度和 pH 条件下,可以水解底物植酸钠,从而生成正磷酸和肌醇衍生物,只要在酸性溶液中,用钒钼酸氨处理,就会生成黄色的【( NH4) 3PO 4 NH 4 VO 3 · 16M O O 3 】复合物,然后我们用分光光度计,在波长 415nm 下进行比色测定就可以了解其酶活性。

 

二、检测方法步骤

 

1.取有代表性样品, 用四分法将试样缩分至200g, 植酸酶产品不需粉碎, 配合饲料和添加剂预混合饲料需粉碎通过0.45mm标准筛,装入密封容器,防止试样成分变化。

 

2.称取样品5000U/g的0.4~0.6g,精确至0.0001g,置于250mL三角瓶中,准确加入100mL乙酸缓冲液(2),放到空气浴摇床上振荡30min或磁力搅拌器上高速搅拌30min,在离心机上以4000r/min离心10min。分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液(2)稀释,使样液浓度保持在0.4U/mL左右,待反应。建议精确移取上清液1mL至25mL容量瓶中,用乙酸缓冲液(2)定容,摇匀。再继续精确移取1mL试液至25mL容量瓶中,定容,摇匀,稀释至31250倍。

 

3.取10mL试管,精确移取2mL稀释液至试管中,同时做试样空白。将样品放入37℃水浴锅预热5min,先将空白加4mL终止液(1.3.7),再将样与空白依次加入4mL底物植酸钠(1.3.3),从加底物开始,向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致,加液后立即混匀,将其放入37℃水浴水解30min;取出后将样品各加入4mL终止液。

 

4.反应后的试样在室温下静置10min,如出现混浊需在离心机(1.4.7)上以4000转/min离心10min,上清液以标准曲线的空白调零在分光光度计415nm波长处测定样品空白(A0)和样品溶液(A)的吸光值,A-A0为实测吸光值,用直线回归方程计算植酸酶的活性。

 

三、酶反应分析

1.酶反应的最适温度

酶反应的最适温度调节恒温水浴锅,在不同温度下(15~70℃)进行酶促反应。以最高酶活为100%,其他条件下的酶活占最高酶活的百分数即为该酶在此温度条件的相对酶活。植酸酶作为一种酶制剂,对温度非常敏感,温度低会降低它的生物活性;温度高也会降低其生物活性,甚至完全失活。植酸酶随着温度的增加,酶活呈上升趋势,到55℃左右酶活达到最高,温度超过55℃后酶活开始下降,通过检测,该酶的最适反应温度为55℃。

 

2.酶反应的最适pH值

配制0.1mol的乙酸-乙酸钠缓冲溶液,在不同的pH值((1.0~7.0)下进行酶促反应。以最高酶活为100%,其他条件下的酶活占最高酶活的百分数即为该酶在此pH条件的相对酶活。通过检测可知,植酸酶的最适pH值在4.0左右。pH值在2.5~5.5,能保持70%以上的酶活,该酶有较宽的pH适宜范围,可以在消化道内充分发挥作用。

 

3.底物浓度对酶活的影响

配制不同反应浓度(0.1~5.0mmol/L)的底物,在常规条件下测定酶活,以最高酶活为100%,在其他条件下的酶活,占最高酶活的百分数即为该酶在此底物浓度下的相对酶活。随着底物浓度的增加酶活逐渐上升,当底物浓度足够大时,酶全部被底物所饱和,此时反应速度达到最大值。随着底物浓度的增加,样品空白的本底值逐渐增大,会影响酶活的测定。

分光光度计

 

四、总结

通过分光光度计法检测,我们可以了解到该酶制剂样品的最适反应温度为 55℃;最适反应pH值为4.0。酶活的测定在饲料用酶制剂产品的质量检验、产品标签和酶活保证方面是必不可少的项目, 而酶活的测定是一种非常细致的工作,所以,我们一定要找准依据标准,深刻理解影响酶制剂酶活测定的主要因素,正确把握各影响因素的关键点,从而才能为企业筛选优质酶制剂、确定复合酶制剂的最佳组方及确定产品的最佳添加量等提供更好的数据支撑。

 

除了GB/T 18634-2009外,如果想检测其他植物酶活性,参考的标准还有 GB/T 23874-2009  《饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法 》、 GB/T 28715-2012《饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法》、 GB/T 33409-2016  《β-半乳糖苷酶活性检测方法 分光光度法》、 GB/T 23881-2009 《 饲用纤维素酶活性的测定 滤纸法》 等等,大家可酌情参考。当然,该重庆某生物制品公司也十分认可我们的检测方案。

 

 

 

 

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