a-氨基酸不仅是蛋白质的最重要的组成成分，也是生物体中最重要的氨基酸，今天我们就a-氨基酸的检测方法-非水滴定法，详细的为大家介绍一下。非水滴定法主要就是针对α-氨基酸的氨基进行测定，当然也可以针对羧基来测定，如在二甲基甲酰胺等碱性溶剂中，以甲醇钾或季胺碱RNOH）等标准溶液来滴定，指示剂可选百里酚蓝，终点颜色由黄变蓝。

一、α-氨基酸检测原理

α-氨基酸的α位碳原子上连有氨基和羧基，故为两性物质，但在水溶液里两者离解趋势很小，溶液酸碱性均不明显（如氨基乙酸的羧基电离H+的Ka=2.5×10-10,氨基接收H+的Kb=2.2×10-12），故在水溶液中无法进行准确的滴定。但在非水介质中有可能被准确滴定。如在冰醋酸体系中，用HClO4的HAc溶液作滴定剂，结晶紫作指示剂，可准确滴定α-氨基酸。滴定后生成物为呈酸性的α-氨基酸的高氯酸盐。结晶紫在强酸性介质中为黄色，pH=2左右为蓝色，pH＞3时为紫色，因而在此强酸滴定弱碱的反应中，一般选由紫色变为稳定的蓝绿色或蓝色为终点，若溶液呈现绿色或黄色则滴定过量，在确定终点时，可用电位计作参比。

若试样难溶于冰醋酸，可加入一定量甲酸作助溶剂，也可加入过量HClO4-冰醋酸，待样品溶解完全后用NaAc-冰醋酸返滴过量的HClO4。HClO4-冰醋酸滴定剂常用邻苯二甲酸氢钾作基准物质进行标定，反应为：

在标定中KClO4有可能被析出，但不影响标定结果

二、α-氨基酸检测仪器和试剂

1.仪器：3.000mL微型滴定管，50mL容量瓶，20mL锥形瓶，干燥小烧杯。

2.试剂：

(1)HClO4-冰醋酸(0.1mol/L)：在低于25℃的250mL冰醋酸中缓慢边搅拌边加入2mL原装（70%～72%）HClO4，混匀后小心加入4mL乙酸酐，搅拌均匀，冷至室温，放置过夜使水分与乙酸酐反应完全。

(2)邻苯二甲酸氢钾基准物质：在105～110℃条件下干燥2h，在干燥器中用广口瓶保存备用。

(3)结晶紫(2g·L-1)冰醋酸溶液

(4)冰醋酸(A.R)

(5)乙酸酐(A.R)

(6)甲酸(A.R)

(7)α-氨基酸试样

三、α-氨基酸检测实验步骤

1．HClO4冰醋酸滴定剂的标定

准确称取0.5g左右KHC8H4O4于小烧杯中，加入30mL冰醋酸，溶解后定量转移至50mL容量瓶内，用冰醋酸稀释至刻度，摇匀。移取2mL于锥形瓶内，加1滴结晶紫指示剂，用HClO4-冰醋酸滴定至紫色转变为蓝绿色，即为终点，平行测定3～5份，各次相对偏差应≤±0.2%。

2．α-氨基酸含量测定

准确称取0.2g试样于小烧杯中，加入30mL冰醋酸、2mL乙酸酐与4mL甲酸，搅拌，若溶解度不高则可适量多加甲酸，待试样溶解后定量转移至50mL容量瓶中，用冰醋酸稀释至刻度，摇匀。移取5mL试液，加1滴结晶紫指示剂，用HClO4-冰醋酸滴至蓝绿色，即为终点，平行测定三次，计算α氨基酸的质量分数。

四、α-氨基酸检测注意事项

1．冰醋酸中的pH值定义与水中相同，但具体数值有区别，指示剂变色范围在HAc中与在水中有区别。 

2．乙酸酐可与水反应生成乙酸，脱去试液中的水分。

3．在非水体系中，甲基紫和结晶紫变化状态相同，可以用甲基紫代替结晶紫作指示剂。

4．冰醋酸在低于15℃时会凝固结冰，而液态冰醋酸体积受温度影响较大，故本实验适宜在天气较暖的春、秋季或有空调的房间内进行。

5．α-氨基酸可选乙氨酸（式量75.07）、丙氨酸（89.09）、谷氨酸(147.13)、异白氨酸（131.13）等易溶于冰醋酸的氨基酸。

6．在非水滴定中仪器必须干燥，否则会影响测定结果。